با استفاده از روش مارتیگل و ضررهای اجتناب ناپذیر

Biol Res 42: 377-389 ، 2009

یک روش نیمه کمی برای نمایش ترکیبات آنژیوژنیک و ترکیبات با پتانسیل آنژیوژنیک با استفاده از رده سلولی اندوتلیال EA. HY926

Evelyn Aranda & Gareth I. اوون

Departamento de Ciencias fisiológicas ، دانشکده de ciencias biológicas ، pontificia universidad católica de Shile ، Alameda 340 ، Santiago ، شیلی.

خلاصه

آنژیوژنز ، توسعه عروق مویرگی جدید ، میزبان تظاهرات بالینی است. شناسایی عوامل که باعث افزایش یا کاهش آنژیوژنز می شوند ، مورد توجه دارویی بسیار خوبی است. از نظر کلاسیک ، آنژیوژنز آزمایشگاهی از سلولهای اندوتلیال ورید ناف انسان (HUVEC) رشد یافته در ماتریژل استفاده می کند. این روش معتبر و ساده دارای اشکالاتی است که هر جمعیت سلولی مجزا و محدودیت به دست آوردن مواد منبع اولیه است. در اینجا ما از رده سلولی اندوتلیال EA. HY926 به عنوان مدل ما برای آنژیوژنز آزمایشگاهی استفاده می کنیم و یک فرمول جدید برای تعیین کمیت بازسازی سلول اندوتلیال برای شناسایی عوامل طرفدار و ضد آنژیوژنیک ارائه می دهیم. علاوه بر این ، تکنیک ما روشهای شناسایی و تعیین کمیت ترکیباتی را که توانایی تولید فاکتورهای طرفدار یا ضد آنژیوژنیک را در هنگام داده های غیر اندوتلیال دارند ، که ما در اینجا به عنوان پتانسیل آنژیوژنیک تعریف می کنیم ، شرح می دهد. در نتیجه ، ما یک فرمول جدید را پیشنهاد می کنیم که با اطمینان ، میزان آنژیوژنز در شرایط آزمایشگاهی را نشان می دهد که به تعیین اندازه گیری ترکیبات آنژیوژنیک آینده نگر اجازه می دهد.

اصطلاحات کلیدی: آنژیوژنز ، EA. HY926 ، HUVEC ، اندوتلیال ، فرمول ، آزمایش آزمایشگاهی ، ماتریگل.

اختصارات مورد استفاده عبارتند از: CM: محیط شرط ؛VEGF: فاکتور رشد اندوتلیال عروقی ؛EGF: فاکتور رشد اپیدرمی ؛HUVEC: سلولهای اندوتلیال ورید ناف انسان. FBS: سرم گاو جنین ؛FVIIA: فاکتور VII فعال شده است. IMDM: رسانه اصلاح شده Dulbecco Iscove ؛DMEM: رسانه Eagle اصلاح شده Dulbecco

معرفی

آنژیوژنی ها

آنژیوژنز توسعه عروق مویرگی جدید است. توسعه داروهای طرفدار آنژیوژنیک و ضد آنژیوژنیک پتانسیل ارائه درمان جدید و مؤثر را مستقیماً هدف قرار دادن آسیب شناسی وابسته به آنژیوژنز دارد (گرسنر و همکاران ، 2007 ؛ پلاودا ، 1997). تعداد زیادی از تظاهرات بالینی که می تواند از درمان ضد آنژیوژنیک بهره مند شود عبارتند از: سرطان ، اختلالات التهابی ، کوری دیابتی ، دژنراسیون عضلانی وابسته به سن ، پسوریازیس ، بیماری های قلبی عروقی و خود ایمنی از جمله بسیاری دیگر. ارائه های بالینی که می تواند از داروهای طرفدار آنژیوژنز بهره مند شود ، بیماری عروق کرونر ، سکته مغزی و تاخیر در بهبود زخم است. در سرطان ، بقا و متاستاز متعاقب تومورهای جامد به نظر می رسد که به نوروسکولار شدن تومور اولیه وابسته است و از تأمین کافی اکسیژن و مواد مغذی اطمینان می دهد (Folkman and Shing ، 1992).

روش آنژیوژنز

در مراحل اول غربالگری برای ترکیبات بالقوه یا ضد آنژیوژنیک بالقوه ، یک روش ساده در شرایط آزمایشگاهی لازم است تا نشانه اولیه اثربخشی را ارائه دهد و در نتیجه الزامات را برای مدل های حیوانی دست و پا گیر و گران تر کاهش دهد. سنجش آزمایشگاهی مورد استفاده برای بررسی آنژیوژنز چندگانه است و بر روی اصل ساده کار می کند که تشکیل ساختارهای مویرگی مانند در ماتریگل (یک نام تجاری از BD Biosc علوم برای مخلوط پروتئین ژلاتینی ترشح شده توسط سلولهای تومور موش که شبیه محیط خارج سلولی پیچیده است. در بسیاری از بافت ها) به آنژیوژنز برون مرزی می شود (گودوین ، 2007). سنجش ها به طور کلی بر استفاده از سلولهای اندوتلیال ورید ناف انسان (HUVEC) ، که از ورید ناف طبیعی انسان جدا شده اند ، تمرکز دارند. اگرچه چندین شرکت خصوصی در حال حاضر این سلول ها را ارائه می دهند ، گران هستند ، اما نیاز به آزمایش برای عوامل بیماری زا دارند و از تعداد زیادی دیگر متفاوت هستند. به طور کلی ، آزمایشگاه های علمی به همکاری با بیمارستان های محلی برای تهیه ورید ناف انسان و انزوا متعاقب آنها و کشت سلول اولیه آنها بستگی دارد. یک مدل جایگزین در شرایط آزمایشگاهی برای آنژیوژنز در سال 1983 با ایجاد رده سلولی EA. HY926 ایجاد شد (Edgell et al. ، 1983 ، 1990 ؛ Bauer et al. ، 1992).

خط سلولی ea. hy926

تأسیس رده سلولی اندوتلیال EA. HY926 توسط دکتر Cora-Jean S. Edgell از دانشگاه کارولینای شمالی ، چاپل هیل ، NC ، ایالات متحده گزارش شده است. این رده سلولی با هیبریداسیون سلولهای اندوتلیال ورید ناف انسان با رده سلولی سرطان ریه A549/8 انسان بدست آمد ، اما جالب برای مدل های آنژیوژنز در شرایط آزمایشگاهی ، فنوتیپ سلولهای اندوتلیال را حفظ کرده است. این رده سلولی توابع بسیار متمایز را نشان می دهد که مشخصه اندوتلیوم عروقی انسان است ، در حالی که مزیت جاودانگی ، ثبات از طریق تعداد عبور و مانند هر رده سلولی ، تکرارپذیری نتایج را ارائه می دهد (Edgell et al. ، 1983 ، 1990). به طور خاص ، دکتر ادگل و سایر محققان نشان داده اند که سلولهای EA. HY926 اجساد اندوتلی ن-1 ، ویبل-پالاد ، پروستاسیکلین ، آنتی ژن مربوط به VHI ، مولکولهای چسبندگی اندوتلیال ICAM-1 و VCAM-1 را بیان می کنند ، همانطور که از ویژگی های اندوتلیال خالص هستندسلولهای کشت شده (Edgell و همکاران ، 1983 ، 1990 ؛ Emeis and Edgell ، 1988 ؛ Thohill et al. ، 1993 ؛ Saijonmaa et al. ، 1991 ؛ Van Oost et al. ، 1986 ؛ Suggs et al. ، 1986). همچنین گزارش شده است که رده سلولی EA. HY926 یک مدل تجربی همگن ارجح است زیرا پاسخ های مداوم تری به متغیرهای خاص و تکرارپذیری بیشتر داده ها می دهد (Eremeeva and Silverman ، 1998). در سال 1992 ، بائر و همكاران ، (1992) نشان دادند كه سلولهای EA. HY926 قادر به تشکیل لوله در هنگام رشد در ماتریگل هستند.

کمیت یک روش آنژیوژنز آزمایشگاهی

سلولهای اندوتلیال از همه منشاء رشد یافته در مارتیگل به نظر می رسد که می توانند به صورت خودجوش توبول ها را تشکیل دهند ، همانطور که توسط طیف گسترده ای از سلولهای اندوتلیال مورد استفاده در این فرآیند نشان داده شده است (به ستون "مدل" در جدول II مراجعه کنید). بنابراین سنجش ماتریگل از تشکیل توبول به یک روش آزمایشگاهی مفید برای مشاهده حداقل دو مرحله کلیدی در مسیر آنژیوژنیک تبدیل شده است. مهاجرت و تمایز سلولهای اندوتلیال. تا همین اواخر ، روشهای ارزیابی آنژیوژنز در شرایط آزمایشگاهی بیشتر توصیفی بود ، یعنی حضور یا عدم وجود لوله یا سازمان سلول سه بعدی آنژیوژنز گزارش شد. با این حال ، به زودی مشخص شد که برخی از عوامل/داروهای ضد آنژیوژنیک خاص بیشتر از سایرین ، آنژیوژنز را در شرایط آزمایشگاهی کاهش داده یا افزایش می دهند ، بنابراین نیاز به یک روش کمی برای اندازه گیری این اختلافات ایجاد می کنند. اندازه گیری های اول از اندازه گیری طول ساختارهای لوله مانند به عنوان یک شاخص آنژیوژنیک استفاده شده است (Yamagishi و همکاران ، 1997). در سال 1998 ، جونز و همكاران ، تعداد سلولهای EA. HY. HY926 را به حساب آوردند و این تعداد را با تعداد كل سلول ها در همان میدان میکروسكوپ تقسیم كردند. تکنیک اندازه گیری انشعاب یا جوانه زدن ، همراه با طول لوله و/یا تعداد لوله های اتصال ، با استفاده از هر سیستم سلول اندوتلیال گزارش شده در ادبیات ، رایج ترین تخمین پتانسیل آنژیوژنیک است. جالب اینجاست که در طی یک جستجوی جامع از ادبیات ، دریافتیم که هیچ فرمول مشترکی اعمال نشده است و در بیشتر موارد روش کمیت بیان نشده است. اگرچه ، هر یک از این روشها نشانگر آنژیوژنز در شرایط آزمایشگاهی در رابطه با ترکیب تحت تجزیه و تحلیل است ، این روش ها برای تشخیص تغییرات کوچک مناسب نیستند. همانطور که در این مقاله با جزئیات بیشتری توضیح داده می شود و مطابق با گزارش های قبلی در هر دو سلول EA. HY926 و مدل های HUVEC ، سازماندهی مجدد سلولهای اندوتلیال پس از تشکیل مخاطبین سلول سلولی وجود دارد و این سازمان با گذشت زمان تغییر می کند. از همه مهمتر برای ایجاد یک مدل آنژیوژنیک ، ما مشاهده کرده ایم که این شکل گیری "مش پیچیده" در حضور عوامل خاص آنژیوژنیک رخ می دهد ، اما نه همه. مقالات اخیر نقاط شاخه و مساحت تحت پوشش توبول ها را مورد مطالعه قرار داده اند (Movafagh et al. ، 2006 ؛ Xu et al. ، 2008). گیدولین و همکاران ، (2004) یک روش تجزیه و تحلیل تصویر را بر اساس پارامترهای توپولوژیکی و فراکتال (برای ارزیابی شکل گیری لوله) توصیف کردند.

آنها هر دو پارامترهای ابعادی را به عنوان اندازه گیری تعداد لوله های تشکیل شده پیشنهاد می کنند. در سال 2006، لیک و همکاران، مقادیر عددی را بر اساس کیفیت و تعداد لوله ها اختصاص دادند. در سال 2008، باسو و همکاران (2008)، رگزایی را در شرایط آزمایشگاهی با یک الگوریتم خودکار که لوله های تشکیل شده از پیوند و خوشه بندی سلول های اندوتلیال را شناسایی می کرد، تجزیه و تحلیل کردند. همه این مطالعات اندازه گیری مراحل مختلف رگ زایی را ارائه می دهند. در اینجا، ما پیشرفت تشکیل لوله در ماتریژل را با استفاده از رده سلولی EA. hy926 نشان می دهیم و فرمولی را ارائه می کنیم که معتقدیم هر مرحله از این فرآیند in vitro را به بهترین نحو ادغام می کند تا امکان کمی سازی را فراهم کند و در نتیجه پتانسیل تمایز بین دو یا چند ترکیب را ارائه دهد. یا تجزیه و تحلیل اثر ترکیبات چنین ترکیباتی. این امر با تخصیص یک امتیاز عددی به هر مرحله از فرآیند از "جوانه زدن"، از طریق تشکیل "چند ضلعی ها" یا "نقوش لانه زنبوری" تا تشکیل "مش های پیچیده" انجام می شود. ما معتقدیم که این روش و فرمول ارزش عددی دقیقی به ترکیبات آینده نگر به روشی ساده، ارزان و سریع می دهد، بنابراین تجزیه و تحلیل و تفسیر نتایج به دست آمده در سنجش رگ زایی آزمایشگاهی، هم در صنعت و هم در آزمایشگاه علمی را تسهیل می کند.

آیا یک ترکیب "رگ زا" است یا دارای "پتانسیل رگ زایی" است؟

دو روش وجود دارد که معمولاً توسط آنها ترکیبات برای نقش آنها در آنژیوژنز آزمایش می شود. در مرحله اول ، سلولهای اندوتلیال یا رده های سلولی مشتق شده اندوتلیال در حضور یک ترکیب تحت معاینه ، با تشکیل یا مهار ساختارهای مویرگی مانند بر روی ماتریگل رشد می کنند. در این سناریو ، ترکیب تحت بررسی می تواند به طور مستقیم بازسازی سلولهای اندوتلیال را تحریک یا مهار کند. این ترکیبات به عنوان طرفدار یا ضد آنژیوژنیک گفته می شود. روش دوم پتانسیل یک ترکیب را برای تحریک فاکتورهای آنژیوژنیک یا ضد آنژیوژنیک بررسی می کند و با افزودن این ترکیب به یک رده سلولی جداگانه ، کشت سلول یا بافت اولیه ، پس از یک دوره زمانی معین به نظر می رسد که به اندازه کافی به نظر می رسد که امکان آزادسازی را فراهم می کندفاکتورهای آنژیوژنیک ، محیط جمع آوری شده (که اکنون به عنوان محیط شرط گفته می شود) ، که با سلولهای اندوتلیال در ماتریژل انکوبه شده و تشکیل ساختارهای مویرگی مانند مورد بررسی قرار می گیرد. در اینجا ، ما نام پتانسیل آنژیوژنیک را به ظرفیت یک ترکیب داده ایم که ، هنگامی که به سلولهای غیر اندوتلیال داده می شود ، می تواند محیط شرطی را ایجاد کند که قادر به افزایش (پتانسیل طرفدار آنژیوژنیک) یا کاهش (پتانسیل ضد آنژیوژنیک) شکل گیری مویرگی باشد. ساختارهای مانند در سلولهای اندوتلیال کشت شده یا رده های سلولی مشتق از سلول اندوتلیال.

مواد و روش ها

کشت بافت₂.

سلولهای رده سلولی اندوتلیال EA. HY926 در محیط اصلاح شده Dulbecco Iscove (IMDM ، Invitrogen ، NY ، USA/ Sigma Aldrich) با 10 ٪ سرم گاوی جنین (FBS) (Invitrogen ، NY ، USA/ Sigma Aldrich) حفظ شد. 100 U/ml Penicillin G ، و 100 میلی گرم در میلی لیتر استرپتومایسین سولفات (Invitrogen ، NY ، USA) در 37 درجه سانتیگراد با 5 ٪ C0

سنجش آنژیوژنز:

در این اندازه گیری از آنژیوژنز در شرایط آزمایشگاهی ، محیط شرطی (CM) از رده های سلولی سرطانی با جوجه کشی ظروف درجه پتری با درجه کشت بافت 60 x 15 میلی متر (Falcon ، Becton Dickinson ، Lincoln ، NJ) با 2 مایل بدون سرم به دست آمد.(SFM) DMEM F12 (متوسط F12 اصلاح شده Dulbecco). با توجه به ماهیت آنها ، رده های سلولی سرطانی دارای فعالیت طرفدار آنژیوژنیک پایه هستند و بنابراین متوسط از این سلولهای کشت داده می شود ، درجه خاصی از سازماندهی مجدد سلول های اندوتلیال را فراهم می کند. سازماندهی مجدد سلول های اندوتلیال پایه بالاتر ، ارجح از غربالگری ترکیبات ضد آنژیوژنیک بالقوه ، با افزودن فاکتورهای طرفدار آنژیوژنیک قبلاً شناسایی شده (کوکتل طرفدار آنژیوژنیک) قابل دستیابی است. علاوه بر این از سرم ، سازماندهی مجدد سلول های اندوتلیال EA. HY926 را نیز افزایش می دهد.

برای اندازه گیری پتانسیل آنژیوژنیک ، ترکیب تحت معاینه به سلولهای سرطانی تحت پوشش متوسط در کشت اضافه شد. پس از یک جوجه کشی 24 ساعته ، متوسط ، که اکنون CM نامیده می شود ، در یک لوله Falcon (Falcon ، Becton Dickinson ، Lincoln Park ، NJ) جمع آوری و در 3000 x گرم به مدت 4 دقیقه سانتریفیوژ شد تا بقایای سلولی را از بین ببرد. سپس این CM برای تعلیق و صفحه سلولهای EA. HY926 روی ماتریژل استفاده شد.₂پیش از این ، 0. 2 مایل از ماتریگل (BD Biosc علوم ، نیو بدفورد ، MA) در هر چاه به صفحات کشت بافت 24 چاه (Falcon ، Becton Dickinson ، Lincoln Park ، NJ) با استفاده از یک پیپت سرد برای جلوگیری از تشکیل حباب ها توزیع شد. ماتریژل به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد با 5 ٪ C0 پلیمر شد

وادسلولهای EA. HY926 تریپسینیزه شدند و 40،000 سلول در حضور CM یا ترکیبات تحت بررسی برای فعالیت های طرفدار یا ضد آنژیوژنیک بر روی ماتریژل قرار گرفتند.

سلولهای EA. HY926 به صورت دوره ای مشاهده شد و با استفاده از فوتومیکروسکوپ کنتراست فاز معکوس با یک هدف 20x عکاسی شد. 10 تصویر نماینده در هر چاه برای تجزیه و تحلیل تصویر به رایانه منتقل شدند.

اطلاعات اضافی₂برای اهداف تجزیه و تحلیل نماینده انجام شده در این مقاله ، رده سلولی سرطان پستان ZR-75-1 (انگل و همکاران ، 1978) در رسانه DMEM/F12 همراه با 10 ٪ FBS (Invitrogen ، NY ، USA) در آن حفظ شد. حضور 100 پنی سیلین U/میلی لیتر و 100 میلی گرم در میلی لیتر استرپتومایسین سولفات (Invitrogen ، NY ، USA) در 37 درجه سانتیگراد با 5 ٪ C0

وادیک کوکتل طرفدار آنژیوژنیک ، متشکل از فاکتور رشد اپیدرمی (EGF ، در غلظت نهایی 10 نانومتر در محیط کشت ، بیوتکنولوژی بالادستی ، NY ، USA) ، فاکتور VLLA (10 نانومتر در محیط کشت ، سیگما-آلدریچ ، سنت لوئیس ، ایالات متحده آمریکا) و پروژسترون (غلظت نهایی 10 نانومتر در اتانول ، سیگما-آلدریچ ، سنت لوئیس ، ایالات متحده) ، 24 ساعت قبل از جمع آوری محیط ، به رده سلولی سرطان پستان اضافه شد. در حضور این کوکتل طرفدار آنژیوژنیک ، جوانه زدن حدود 1-2 ساعت آغاز شد و بازسازی تقریباً در 12 ساعت کامل شد. به منظور نشان دادن فعالیت ضد آنژیوژنیک ، ما از متابولیت استروژن ضد آنژیوژنیک 2-متیوکسیسترادیول شناخته شده (2ME ، استرولوئیدها ، Inc ، Wilton ، NH ، USA) استفاده کردیم (Mabjeesh et al. ، 2003 ؛ Ricker et al. ، 2004 ؛برهن و همکاران ، 2008) در غلظت های بیان شده در افسانه های شکل مربوطه. برای نشان دادن پتانسیل طرفدار آنژیوژنیک ، ما از فاکتور VLLA در غلظت نهایی 10 نانومتر در سانتی متر مربوط به سلولهای ZR-75 استفاده نکردیم که با کوکتل آنژیوژنیک فوق الذکر درمان نشده اند. تجزیه و تحلیل آماری با تجزیه و تحلیل آزمون t دانشجویی با اهمیت تعیین شده در P انجام شد

تفسیر نتایج:

اگرچه رشد EA. HY926 در ماتریگل ثبت شده است ، در بخش زیر ما این روند را با جزئیات بیشتری گزارش می دهیم تا اصطلاحات خود را معرفی کنیم و یک ارتباط عددی را در هر مرحله توجیه کنیم. یک عامل مهم تعداد سلولهای EA. HY926 است که بر روی ناحیه ماتریگل قرار گرفته است. تعداد بسیار کمی از سلول ها نمی توانند شبکه ها را تشکیل دهند ، در حالی که تعداد زیادی سلول شمارش را و تفسیر نتایج دشوارتر می کنند. هنگامی که در حضور رسانه های مناسب (سرم یا فاکتور حاوی متوسط یا CM از سلولهای کشت شده) بر روی ماتریگل قرار می گیرد ، ea. hy926 در ساعت اول شروع به سازماندهی مجدد می کند. سلول ها به عنوان اشکال کروی شروع می شوند (پانل 1 ، شکل 1) ، اما به سرعت صاف می شوند و شروع به نمایش پیش بینی می کنند. این فرآیند معمولاً به عنوان جوانه زدن گفته می شود (جدول I ؛ پانل 2 ، شکل 1). در این مدت ، مهاجرت سلولی مشاهده می شود ، در نتیجه نزدیکی سلولهای EA. HY926. این پدیده ای است که در طول فرآیند ادامه خواهد یافت. این جوانه ها با پیش بینی های مشابه که از سلولهای دیگر سرچشمه می گیرند برای ایجاد یک تماس سلول سلولی ، که ما نام سلولهای متصل را تعیین می کنیم (جدول I ؛ پانل های 3 و 4 ، شکل 1). این فرایند بین سلول ها ادامه می یابد و ممکن است شامل چندین پیش بینی از همان سلول باشد تا یک سری ساختارهای چند ضلعی در هنگام مشاهده در زیر میکروسکوپ تشکیل شود (پانل 5-8 ، شکل 1). این شکل گیری از ساختارهای چند ضلعی نیز توسط نویسندگان دیگر به عنوان "تشکیل لانه زنبوری" گفته شده است (دورل و همکاران ، 2002). بر اساس مطالعات ما ، ما مشاهده کرده ایم که برخی از ترکیبات آزمایش شده دارای پتانسیل طرفدار آنژیوژنیک برای سازماندهی مجدد در این مرحله هستند اما دیگر پیش نمی روند. مرحله زیر شامل تقریب سلول ها برای تشکیل ساختارهای چند ضلعی است که دارای دیواری هستند که دو تا سه سلول ضخامت دارد (پانل 7 ، شکل 1). حضور این سازه ها به نام مش پیچیده داده می شود. این مرحله مهاجرت سریع را نشان می دهد و به عنوان یک تعمیم ، اما یک قاعده ، ممکن است شامل از دست دادن تعداد ساختارهای چند ضلعی باشد. نمی توان رد کرد که در طی این فرآیند ، در واقع در طی فرایند به عنوان یک کل ، تقسیم سلولی در حال وقوع است.

با این حال ، بر اساس تجربه ما در شمارش بسیاری از زمینه های میکروسکوپی فردی ، تفاوت عمده ای در تعداد سلول وجود ندارد ، خواه سلول ها در حال تشکیل توبول باشند یا نه ، و نه در هر مرحله فردی از این فرآیند. این نقطه در شکل 2C و 2D نشان داده شده است ، که در آن خطای استاندارد نشان دهنده نوسانات در تعداد سلول در زمینه های نوری برای هر شرایط آزمایش شده است. از آنجا که این مش پیچیده ، چند ضلعی بیشتری ناپدید می شود و با ساختارهای گرد بزرگتر با دیواره های چهار تا پنج سلول ضخیم جایگزین می شوند (پانل 8 ، شکل 1). حداقل در تجربه ما به نظر می رسد این حالت میزان بازسازی EA. HY926 در ماتریگل است. مدت زمان طولانی یا افزودن سرم جدید حاوی محیط ، فرم را تغییر نمی دهد. در مقابل ، اگر محیط بعد از 24 ساعت اول تغییر نکند ، EA. HY926 شروع به از بین رفتن اتصالات خود می کند ، ظاهری تیره تر و گرد تر نشان می دهد که نشانگر مرگ سلولی است. زمان این فرآیند دلخواه است. بسته به عوامل آنژیوژنیک مورد استفاده ، این کل فرآیند می تواند طی شش ساعت یا بیشتر از 20 ساعت انجام شود. بنابراین ، این روش بسته به ترکیب مورد تجزیه و تحلیل (و سلولهای مورد استفاده برای به دست آوردن CM) برای تفسیر باز است. اگر این ترکیب در حال تجزیه و تحلیل باشد تا آزمایش کند که آیا خاصیت آنژیوژنیک دارد ، پاسخ یک بله یا خیر ساده است. اگر با این حال ، دو ترکیب طرفدار یا ضد آنژیوژنیک مورد بررسی قرار می گیرند ، ممکن است اختلافات از نظر سینتیک دو ترکیب در توانایی آنها برای ایجاد بازسازی EA. HY926 تفسیر شود.

شکل 1a: مراحل مختلف مشاهده شده در آزمایش آزمایشگاهی آنژیوژنز.(1) سلولهای EA. HY926 بلافاصله پس از بذر اولیه بر روی ماتریژل ، (2) سلولهای EA. HY926 شروع به جوانه زدن می کنند ، (3-4) سلولهای EA. HY926 دراز کشیده و شروع به اتصال می کنند. در (5) و (6) سلول های EA. HY926 ساختارهای چند ضلعی را تشکیل می دهند. سرانجام ، سلولهای EA. HY926 مشبک های پیچیده ای از 2-3 سلول از نظر ضخامت (7) یا بیشتر (8) را تشکیل می دهند. شکل 1B: فرمول برای تعیین نمره آنژیوژنیک.

جدول I. تعاریف اصطلاحات مورد استفاده در سنجش های آنژیوژنز و در این مقاله معرفی شده است.

تشکیل توبول یا لوله ، سازه های توبولار ، بند ناف ، سازه های بند ناف ، تشکیل کابل ، پشته ها ، ساختار عروق مانند ، توبول یا شاخه های لوله ای.

پیش بینی های سلولی EA. HY926 ، که منجر به تماس با سلولهای دیگر نمی شود.

توانایی یک ترکیب (ها) برای افزایش یا کاهش توانایی محیط شرط حاصل از سلولهای غیر اندوتلیال برای افزایش یا کاهش ساختار مویرگ سلول مانند سلول اندوتلیال در ماتریژل

توانایی یک ترکیب (ها) برای افزایش (طرفدار) یا کاهش (ضد) تشکیل ساختار مویرگی در ماتریژل زمانی که مستقیماً به سلول های اندوتلیال پوشش دهنده محیط اضافه شود.

شکل 2: کاربرد روش رگ زایی EA. hy926 برای غربالگری ترکیبات آزمایشی.(الف) سنجش پتانسیل رگ زایی: سلول های EA. hy926 با CM از سلول های سرطان سینه درمان نشده (شاهد) یا به مدت 12 ساعت با یک ترکیب با پتانسیل شناخته شده رگ زایی، FVIIa، انکوبه شدند. پتانسیل رگ زایی به عنوان درصد تغییر امتیاز برای بازسازی سلول در مقایسه با کنترل نشان داده می شود.(B) سنجش رگ زایی: سلول های EA. hy926 با CM (مشتق شده از سلول های سرطانی تیمار شده با کوکتل رگ زایی) و امتیاز رگ زایی حاصل از فرمول 100% (کنترل II) انکوبه شدند. FVIIa و غلظت های فزاینده ترکیب ضد رگ زایی شناخته شده، 2ME، در لحظه ای که سلول های EA. hy926 اندود شدند اضافه شد و امتیاز رگ زایی 12 ساعت بعد محاسبه شد. مقادیر به عنوان درصد کنترل (کنترل II) از حداقل سه آزمایش مستقل بیان می شوند.* اهمیت آماری با توجه به هر مجموعه کنترل در p

برای تعیین کمیت این روش آنژیوژنز ، سلولهای آزمایشگاهی به صورت دوره ای حذف می شوند (ما دریافتیم که تجزیه و تحلیل بیهوده کافی خواهد بود) از انکوباتور ، در صورت لزوم ارزیابی و عکاسی می شود. ما دریافتیم که 10 عکس در هر چاه (در هر درمان) نمای بیش از حد کافی از فرآیند آنژیوژنیک که در حال وقوع است را ارائه می دهد. انتخاب این 10 زمینه/عکس دلخواه است ، اما به نظر محقق باید نماینده ترین چاه باشد. این روش بیش از 10 زمینه تصادفی یا 10 زمینه ثابت مطلوب است ، زیرا مهاجرت سلولی چنین نقش جدایی ناپذیر در فرآیند آنژیوژنیک دارد. برای اهداف شمارش ، فرمول آنژیوژنز در شرایط آزمایشگاهی یا پتانسیل آنژیوژنیک در شکل 1B نشان داده شده است. هر سلول در قسمت نوری شمارش می شود و به این شماره به عنوان "تعداد کل سلول ها" گفته می شود. به هر سلول که جوانه زدن را نشان می دهد نمره 1 امتیاز داده می شود. هنگامی که دو یا چند طولانی مدت سلول های متصل را متحد و فرم می کنند ، نمره 2 امتیاز به هر سلول درگیر در این فرآیند اهدا می شود. تشکیل چند ضلعی یک مقدار اضافی واحد 3 امتیاز داده می شود. بیش از یک چند ضلعی می تواند در هر زمینه وجود داشته باشد ، بنابراین سه ضلعی در مجموع نه امتیاز به نمره داده شده برای سلولهای جوانه زده و متصل می دهد. این مقادیر همانطور که در فرمول 1 محاسبه می شود ، و بنابراین نمره جوانه زدن ، سلولهای متصل و چند ضلعی ها توسط تعداد کل سلول ها تقسیم می شوند. وجود یک مش پیچیده (ساختارهای لومین متشکل از دیواره های دو تا سه سلول ضخامت) نمره 1 داده می شود و به مقدار کل اضافه می شود. این نمره یک بار در هر زمینه نوری اضافه می شود. اگر این ساختار پیچیده وجود داشته باشد و دیوارها چهار یا چند سلول ضخامت داشته باشند ، به یک نمره 2 اهدا می شود. عدم وجود مش پیچیده دارای نمره 0 امتیاز است. نمره نهایی فردی که از فرمول حاصل می شود ، در کل ده به عنوان یک مقدار گرفته می شود ، با میانگین و انحراف معیار در برابر سایر شرایط درمانی. با در نظر گرفتن مثال شکل 1A (فرضیه این پانل ها به عنوان نتایج فردی به دست آمده در همان زمان) ، جدول III نشانگر تعیین امتیاز و نمره کل برای هشت صفحه است.